农杆菌介导的O型口蹄疫病毒P12A*3C基因转化玉米研究

Journal: 中国兽医科学，2010, 40(3)：226--230

Author: 张桂玲，张素芝, 荣廷昭，张永光

Abstract:

口蹄疫（Foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，FMDV）引起的一种急性、高度接触性传染病。疫苗接种是预防口蹄疫的主要措施。近年来，随着植物基因工程的发展，用转基因植物表达口蹄疫抗原相对于传统疫苗更经济、更安全。目前口蹄疫植物转基因疫苗的研究中所用的受体植物主要为模式植物拟南芥、烟草、马铃薯、苜蓿等，对动物的适口性差，或需加工提纯后才能食用，从而导致抗原蛋白丧失部分活性。本研究选取了玉米作为转化受体，通过农杆菌介导法将FMD抗原基因P12A*3C进行转化，获得了转基因阳性植株，为FMD转基因疫苗的研究奠定了基础。 本实验在已构建O型口蹄疫P12A*3C基因高效植物表达载体pC1300P12A*3C的基础上，通过农杆菌介导法转化优良的玉米自交系18-599（W）和416051的胚性愈伤组织。共培养3d后，在含潮霉素（HygB）5 mg/L、10 mg/L、15 mg/L的培养基上连续筛选3代获得抗性愈伤组织，然后分化得到再生植株。PCR检测初步表明目的基因已经整合到再生植株中。RT-PCR检测表明目的基因在再生植株中得到表达。此外，本实验还探讨了菌液浓度、高渗处理、侵染前预培养及恢复培养等对转化效率的影响。 实验结论如下 1）由于受多个因素的影响，液体培养时根癌农杆菌达到对数生长期的时间不固定，对侵染液浓度经常观察检测是一种稳定可靠的方法。本试验发现在OD600=0.5时，侵染后得到的阳性愈伤率最高。 2）对愈伤组织进行高渗处理、侵染前预培养以及侵染后恢复培养可以有效地提高抗性愈伤率。 3）共培养温度过高导致农杆菌生长过度，后期污染严重，很难脱菌，而较低的温度能抑制农杆菌的过度生长，从而提高玉米愈伤组织的转化率。 4）PCR扩增、PCR-Southern和RT-PCR检测初步证明P12A*3C基因已经整合到再生玉米植株的基因组中并表达，并获得了T1代种子。

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