Plant Biotechnology Journal | 四川农业大学玉米研究所基于ZmKO1开发经济高效的玉米两系不育化杂交制种技术

近日，Plant Biotechnology Journal杂志在线发表了由四川农业大学兰海和曹墨菊课题组撰写的“Engineering a Gibberellin-Switchable Dual-Use Line Based on Ent-Kaurene Oxidase Gene ZmKO1 Enables Two-Line Hybrid Seed Production in Maize”论文。该研究工作通过图位克隆确定玉米赤霉素生物合成路径上贝壳杉烯氧化酶基因ZmKO1突变可导致赤霉素合成缺陷型雄性不育。虽然突变体可产生活性正常的花粉粒，但由于雄花小穗花丝伸长受阻、颖壳不能张开、花药不能外露散粉而表现为雄性不育。外源喷施赤霉素可恢复突变体育性，实现自交繁殖，表现出一系两用特性，据此构建了全新的赤霉素可控型玉米两系法不育化杂交制种技术Gibberellin-Switchable Dual-Use Line (GDL)。

雄性不育是高等植物中普遍存在的一种生物学现象。随着农业生产上杂种优势的广泛利用，雄性不育的研究和应用已成为植物育种学的重要内容。玉米是杂种优势利用最成功的作物之一，目前玉米生产用种基本全为杂交种，主要通过物理去雄来实现玉米杂交种商业化生产。去雄在很大程度上决定了玉米制种产量和质量，是制种的关键环节。物理去雄分为人工去雄和机械去雄，随着我国城镇化发展，农村劳动力减少，人工去雄成本逐年攀升；而机械去雄对植株损伤大，导致制种产量降低；同时，去雄不彻底不及时还会导致种子纯度降低。利用雄性不育系开展不育化杂交制种是解决玉米去雄难题的重要手段，玉米不育化制种的需求也愈来愈迫切。

可遗传的植物雄性不育按不育基因的遗传来源划分为细胞核雄性不育（Genic Male Sterility，GMS）和细胞质雄性不育（Cytoplasmic Male Sterility, CMS）。玉米是世界上最早利用CMS进行不育化杂交制种的主要作物之一。20世纪50年代，玉米CMS-T首次应用于杂交制种，提升了玉米制种效率和制种产量。到20世纪60年代，美国基本普及了CMS-T不育化制种，由于T型不育胞质材料对玉米小斑病T小种表现高度的专化感染，导致20世纪70年代初玉米小斑病在美国爆发流行，减产严重，CMS在玉米制种上的应用也因此进入低潮。目前，我国利用CMS生产的杂交种占比仍然较低，推广规模有限，主要原因是CMS胞质遗传基础狭窄导致的病害风险、育性不稳定性、恢复机制复杂带来的选育困难以及三系配套系统的繁琐性。

相较于CMS不育化制种存在的问题，败育稳定的GMS遗传资源丰富，且绝大部分玉米GMS基因为隐性基因，理论上任何杂交组合均能利用GMS进行不育化制种。因此，GMS更适合用于玉米不育化杂交制种。但由于其细胞核遗传特性，难以规模化繁殖不育系种子，极大阻碍了GMS在玉米杂交制种中的应用。随着分子生物学和转基因技术的发展，构建了不同的技术方案如双组分生物技术雄性不育系统、可诱导雄性不育系统、转基因驱动的非转基因种子生产技术等（Wan et al., 2019），解决了GMS不育系如何高效繁殖的难题。目前应用于玉米杂交制种的有孟山都开发的可诱导雄性不育系统Roundup Hybridization System (RHS)（Feng et al., 2014）和杜邦先锋开发的转基因驱动非转基因种子生产系统Seed Production Technology (SPT)（Wu et al., 2016）。

RHS是一种基于草甘膦诱导雄性不育的玉米杂交种子生产技术。该系统由RHS和RR两种转基因载体组成。RHS载体包含由增强型35S启动子驱动的CP4-EPSPS基因，该基因编码对草甘膦不敏感或耐受的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶。由于该启动子驱动的CP4-EPSPS在绒毡层细胞和小孢子中表达水平很低，而在植株其他组织高表达，导致在特定时间窗口喷洒草甘膦后，RHS植株表现出雄性不育，但对植株其他部分几乎不造成伤害。RR载体包含一个双重表达盒，能组成型高表达CP4-EPSPS，使全株组织对草甘膦具有强耐受性。在杂交种子生产田中，通过对全田植株进行顶部喷洒草甘膦，诱导RHS母本植株产生雄性不育，只能接受RR父本植株产生的花粉，实现杂交制种。而在不喷洒草甘膦的条件下，RHS植株可通过自花授粉繁殖。RHS系统利用草甘膦喷洒替代物理去雄，极大地简化了杂交玉米种子生产过程。但制种双亲及杂交种均为转基因，且全田喷施草甘膦，引发了对其生态和健康影响的担忧。此外，RHS系统通过在特定时间窗口内喷施草甘膦来诱导雄性不育，田间植株的发育不同步性要求更精确的操作规程，以确保育性满足生产要求，这些因素限制了该技术的推广。

SPT技术核心是利用转基因驱动非转基因杂交种子的生产。该技术通过向含有msms不育基因的细胞核雄性不育系中转入一个SPT转基因载体来创建SPT转基因保持系。该载体包含三个表达盒：可表达野生型Ms基因的表达盒，用于恢复保持系雄花育性；可表达花粉致死融合基因Bt1:Zmaa1的表达盒，用于失活保持系转基因花粉；可表达红色荧光蛋白的种子颜色标记基因表达盒，用于转基因保持系种子筛选。在SPT保持系产生的花粉中，50%为非转基因（ms/-），50%含有SPT转基因元件（ms/SPT）。SPT保持系同样可产生非转基因（ms/-）和转基因（ms/SPT）两种基因型的雌配子。由于SPT转基因元件含有花粉特异性致死基因，使得转基因花粉失活。因此，SPT保持系自交只产生两种基因型种子：SPT转基因保持系种子（msms/SPT-）和非转基因雄性不育系种子（msms/--）。通过色选机可高效分离出转基因SPT保持系种子和非转基因的雄性不育系种子，实现SPT保持系的繁殖。进一步，利用雄性不育系做母本，SPT保持系做父本进行杂交，不育系植株上产生的种子均为非转基因雄性不育系种子，进而实现不育系的商业化繁殖，用于后续杂交制种。尽管SPT技术实现了不育系的高效繁殖且生产的是非转基因杂交种，但仍然存在0%至0.518%的转基因漂移概率（Wu et al., 2016）。即使最终的种子分选步骤能降低转基因种子进入杂交田的风险，但在不育系繁殖阶段，通过转基因中间亲本仍存在转基因花粉漂移的潜在风险，导致其在生物技术监管严格的地区应用受限。同时，由于SPT转基因元件串联了三个片段较大的表达盒，也存在通过染色体交换重组发生的系统性风险。

四川农业大学兰海教授团队筛选到一份GMS突变体defective in filament elongation 1 (def1)，外源喷施赤霉素可恢复突变体育性，实现不育系的自交繁殖，具备一系两用特性，通过分子标记辅助回交转育和基因编辑技术可快速创制不同自交系背景下细胞核雄性不育两用系，实现了玉米单交种川单99的两系法不育化杂交制种。全文主要研究结果如下：

1. def1是单基因控制的隐性GMS突变体

研究者从玉米空间诱变后代筛选到一份雄性不育突变体def1，除了雄花育性表现外，def1与野生型WT相比，其他性状无明显差异（图1a-1d）。def1雄性不育主要表现为雄花小穗颖壳不张开、花丝伸长受阻，花药不能外露散粉（图1e）。值得注意的是，def1虽然表现为雄性不育，但小孢子发育正常，可产生活性正常的花粉粒（图1f、1g）。遗传分析表明def1是单基因控制的隐性GMS突变体。

图1 def1突变体与野生型WT表型比较

1. ZmKO1突变导致了def1雄性不育

利用def1与自交系Mo17组配的F²分离群体，通过多态性分子标记定位将突变位点定位在9号染色体1.24 Mb区间内，该区间注释到11个蛋白编码基因（图2a）。通过序列比较分析，发现def1与WT相比，ZmKO1第1外显子存在一个5202-bp的大片段插入，使ZmKO1转录本第1外显子19-bp的序列替换成一段82-bp的片段，最终导致导致氨基酸序列移码突变和蛋白翻译提前终止（图2b）。构建Ubi启动子ZmKO1表达的表达载体，转化自交系B104，获得7个转基因阳性株（T0-1~T0-7）（图2c）。通过基因型与表型分析，确定转基因可以恢复纯合突变背景下植株的育性（图2d-2f）。进一步，利用CRISPR/Cas9基因编辑，证明敲除ZmKO1可产生和def1类似的雄性不育（图2g、2h）。同时，从EMS突变体库中搜索到一份ZmKO1无义突变，纯合突变植株雄花也表现出颖壳张开受到抑制（图2i）。以上结果表明，ZmKO1突变导致了def1雄性不育。

图2 def1突变体基因克隆

1. def1为赤霉素合成缺陷型雄性不育，基于ZmKO1可创制雄性不育两用系

Mao等人（2017）研究表明ZmKO1蛋白在大肠感觉表达系统中具有贝壳杉烯氧化酶功能，但在玉米自身体内的功能还未知。研究者测定了WT和def1雄花小穗中贝壳杉烯酸和11种赤霉素（包括具有生物活性的GA1、GA3、GA4和GA7）含量，发现def1与WT相比，贝壳杉烯酸和10种赤霉素含量显著降低，只有GA3在def1中含量高于WT（图3a），说明ZmKO1在玉米自身体内行使贝壳杉烯氧化酶功能，参与赤霉素的生物合成。分别外源喷施活性赤霉素GA1、GA3、GA4和GA7都能恢复def1雄花开花散粉，表明def1为赤霉素合成缺陷型雄性不育（图3b）。进一步，研究者通过分子标记辅助回交转育和CRISPR/Cas9基因编辑技术，衍生了不同自交系背景下def1不育系（Zheng58-def1、DH351-def1、Jing724-def1、PH6WC-def1、B73-def1、ZNC442-def1、Mo17-def1、Y9614-def1、B104-def1、SCML0849-def1）。这些不育系在自然条件下都表现为雄性不育，外源喷施GA3则表现为育性恢复，可正常开花散粉，且自交结实正常（图3c、3d)。上述结果表明def1为赤霉素合成缺陷型雄性不育，基于ZmKO1可创制不同遗传背景下雄性不育两用系。

图3 基于ZmKO1突变创制雄性不育两用系

1. 基于def1不育系一系两用特点构建玉米两系法不育化杂交制种技术

研究者在海南乐东、甘肃临泽、新疆伊宁、四川成都、宁夏青铜峡、西双版纳景洪对不同自交系背景下def1不育系进行了育性观察，表明一系两用特点不受环境和遗传背景影响。赤霉酸（有效成分为GA3）价格便宜，为农业生产上常用生长调节剂。作者以一款市售赤霉酸（~1.6元/克；GA3含量为75%）用来进行不育系大规模繁殖。在规模化繁殖不用系时，施用浓度为75mg/L，施用量40L/亩，喷施后第二天不育系就可正常开花散粉（图4a-4d）,实现def1两用系繁殖。据此，作者构建了赤霉素可控型两系杂交制种技术Gibberellin-switchable Dual-use Line (GDL)，且利用该技术开展了川单99的不育化杂交制种（图4e）。

图4 玉米GDL两系法不育化杂交制种技术

这项研究开发不仅首次利用遗传学证据鉴定了玉米赤霉素合成路径上的KO酶基因，同时基于ZmKO1位点构建了操作简单、经济高效、生态友好的玉米两系法雄性不育杂交制种技术，完美规避了CMS系统、RHS系统以及SPT系统的短板，为解决玉米杂交制种去雄难题提供了更优的解决方案。该研究工作得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、四川省重大科技专项、四川省科技支撑计划等项目的资助。

论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70608

参考文献

Wan X, Wu S, Li Z, Dong Z, An X, Ma B, Tian Y, Li J (2019) Maize Genic Male-Sterility Genes and Their Applications in Hybrid Breeding: Progress and Perspectives. Mol Plant. 12(3):321-342.

Wu Y, Fox TW, Trimnell MR, Wang L, Xu RJ, Cigan AM, Huffman GA, Garnaat CW, Hershey H, Albertsen MC (2016) Development of a novel recessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops. Plant Biotechnol J. 14(3):1046-1054.

Mao H, Shen Q, Wang Q (2017) CYP701A26 is characterized as an ent-kaurene oxidase with putative involvement in maize gibberellin biosynthesis. Biotechnol Lett. 39(11):1709-1716.

Feng PC, Qi Y, Chiu T, Stoecker MA, Schuster CL, Johnson SC, Fonseca AE, Huang J (2014) Improving hybrid seed production in corn with glyphosate-mediated male sterility. Pest Manag Sci. 70(2):212-218.